Capítulo 1. La fluorescencia, haciendo visible lo invisible
La luz visible por el ojo humano (luz blanca) es una pequeña banda del espectro electromagnético que incluye diferentes tipos de radiaciones (rayos gamma, rayos X, ultravioleta, visible, infrarrojo, microondas, ondas de radio). El rango espectral de la luz blanca comprende de los 400 a los 700nm, aunque algunas personas pueden percibir entre los 380 y 780nm. A su vez, la luz blanca engloba a radiaciones con diferentes longitudes de onda que corresponde a colores concretos.
Aunque convencionalmente se nombran y se separan los colores que aparecen al hacer pasar la luz blanca por un prisma que dispersa la luz en sus componentes, la realidad es que la variación del color a lo largo del espectro es continuo y no existen saltos entre los diferentes colores (figura 1). Por otro lado, una radiación electromagnética monocromática sólo contiene un componente de una determinada longitud de onda, como es el caso de la luz láser.
Aunque convencionalmente se nombran y se separan los colores que aparecen al hacer pasar la luz blanca por un prisma que dispersa la luz en sus componentes, la realidad es que la variación del color a lo largo del espectro es continuo y no existen saltos entre los diferentes colores (figura 1). Por otro lado, una radiación electromagnética monocromática sólo contiene un componente de una determinada longitud de onda, como es el caso de la luz láser.
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Figura 1: Algunas formas de radiación electromagnética, que incluye los rayos gamma, rayos X (RX), radiación ultravioleta (UV), visible, radiación infrarroja (IR) y microondas. Se muestra la banda del espectro electromagnético correspondiente a la luz visible y las longitudes de onda que corresponden a diferentes colores. Cuanto menor es la longitud de onda, mayor es la frecuencia y mayor es la energía asociada.
La microscopia de fluorescencia se basa en la capacidad que tienen ciertas moléculas para absorber energía procedente de una estrecha banda del espectro de la luz, habitualmente expresado con el valor de la longitud de onda donde tiene su máxima absorción seguido de la emisión de luz en un rango de longitud de onda mayor (figura 2).
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Figura 2: Hipotético fluorocromo capaz de
abosrber radiación entre los 350 nm y los 460nm, teniendo un pico máximo de
absorción a los 420nm, estas longitudes de onda corresponden a la franja de luz
azul dentro del espectro visible. A su vez, este fluorocromo es capaz de emitir
luz verde en la franja comprendida entre los 440 nm y los 600, teniendo su
máximo a los 480nm.
Gracias a esta propiedad de absorber y emitir luz en determinadas franjas del espectro de luz y a la existencia de tinciones, anticuerpos y sondas específicas, se pueden combinar obteniendo resultados espectaculares. Estos resultados se pueden enmarcan en su contexto celular, de órgano o de organismo (figura 3).
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Figura 3: Imagen de microscopía de
fluorescencia confocal. Cultivo de células pulmonares, en azul está teñido el
núcleo, en verde el citoesqueleto de actina y en rojo las mitocondrias.
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Junto a este hecho transcendental ocurrieron otros dos que supusieron colocar a la microscopía óptica en la punta de lanza de la investigación biológica. Por un lado se desarrolló el sistema confocal que permitía obtener imágenes de alta calidad y resolución eliminando la luz fuera de foco y por otro, la accesibilidad a equipos informáticos potentes, capaces de almacenar gran cantidad de información a una velocidad aceptable y a unos costes razonables.
Los microscopios de epifluorescencia comenzaron a utilizarse de manera habitual en los laboratorios a principios de la década de los 70 del siglo pasado. Las primeras aplicaciones en las que se empleó se basaron en la observación de la fluorescencia primaria, o autofluorescencia que poseen determinadas sustancias. Pero el boom no llegaría hasta los años 90, cuando se comenzó a manipular el gen que codifica la proteína verde fluorescente (GFP), aislada de la medusa Aequorea victoria, mejorando sus propiedades y obteniendo una serie de proteínas derivadas capaces de ser excitadas y emitir fluorescencia en otras longitudes de onda diferentes al verde.
