Los anticuerpos en el diagnostico clínico, inmunofluorescencia indirecta

Una de las técnicas más habituales en un laboratorio de biomedicina es la inmunofluorescencia indirecta, que se emplea tanto como herramienta de investigación como de diagnóstico clínico.

Los anticuerpos forman parte de nuestro sistema inmunitario y el organismo los genera para defendernos contra los patógenos. Son de una gran especificidad y es esta propiedad la que los hace tan útiles para emplearlos como herramientas de laboratorio.

Aquí hablaremos de esta técnica como método de diagnóstico, como ejemplo pondré un supuesto de parasitismo por Trichinella spiralis.

Cuando una persona entra en contacto con un agente patógeno, el organismo empieza a defenderse de el con una gran batería de elementos que configuran el sistema inmunitario. Intervienen elementos celulares como los macrófagos y neutrófilos. Dentro de una compleja respuesta inmunitaria en la que participan células presentadoras de antígenos y linfocitos de diferentes tipos se llaga a obtener una respuesta contra el patógeno muchos más específica y selectiva, que además proporciona memoria inmunitaria, se producen los anticuerpos.

Si en el suero de la sangre de un paciente observamos la presencia de anticuerpos contra un determinado patógeno, podemos decir que dicho paciente ha estado en contacto con ese patógeno, y puede que haya superado la infección o no.

Las técnicas de análisis en las que se emplean los sueros de los pacientes se denominan pruebas serológicas.

El laboratorio de diagnóstico mantiene en cultivo a los parásitos que le servirá de base para sus ensayos. Una vez que llegan las muestras procedentes de los pacientes sospechosos de tener triquinosis se obtiene el suero de la sangre. Si el paciente está infectado y no está inmunodeprimido, en su suero aparecerán anticuerpos específicos contra este parásito. Dentro de la variedad de anticuerpos que puede producir el sistema inmunitario, los que nosotros intentaremos detectar son las inmunoglubulinas G (IgG).

Figura 1 Esquema del proceso

Primero se cogen unos pocos parásitos de los que se disponen en el laboratorio (1), se les añade el suero del paciente sospechoso (2). En el caso de que el paciente presente anticuerpos específicos contra este parásito, éstos se le unirán, se deja una incubación de una hora para dar tiempo a que se unan mediante la reacción Antígeno-Anticuerpo (3). Después se añade un anticuerpo comercial que es capaz de unirse a las IgG del paciente (4). Esto es, este segundo anticuerpo lo que reconoce y a lo que se pega es a las IgG humanos (5); además este anticuerpo comercial lleva conjugado a él una partícula fluorescente que nos permitirá detectarlo mediante la observación en el microscopio de fluorescencia y podremos observar qué muestras son positivas y qué muestras son negativas (6). Esta técnica es la Inmunofluorescencia indirecta.

Figura 2

A) Caso positivo de un paciente que presenta anticuerpos IgG contra Trichinella spiralis, el anticuerpo secundario es un Anti-IgG humano conjugado con un fluorocromo que emite fluorescencia en la franja verde del espectro de luz. B) Imagen en campo claro. C) Control negativo, en este caso se realizó la inmunofluorescencia con el suero de una persona que no presenta anticuerpo contra este parásito. D) Imagen de campo claro.

El cultivo de los parásitos y las pruebas diagnósticas se han realizado en el Servicio de Parasitología del Centro Nacional de Microbiología. Por cortesía de las doctoras Esperanza Rodríguez de las Parras y Sonsoles Jiménez Sánchez (Unidad de Diagnóstico y Referencia de Parasitosis, Servicio de Parasitología, CNM, ISCIII).

Ya trabajamos bajo criterios de calidad

Después de más de un año trabajando para acreditarnos por la Normativa de calidad ISO 9001, ya lo hemos conseguido, estos son los logos de la certificación por AENOR y el Alcance que cubre:

Alcance: La recepción de muestras biomédicas y su distribución a los laboratorios del Centro Nacional de Microbiología. La producción de anticuerpos monoclonales. La asistencia científico-técnica, formación y adquisición de imágenes de muestras fijadas por microscopía confocal. La asistencia científico-técnica, formación y realización de ensayos por citometría de flujo analítica y preparativa (separación celular). 

Medical specimen collection and distribution in the Microbiology National Center Laboratories. The production of monoclonal antibodies. The scientific and technical advice, training and image acquisition of fixed samples by confocal microscopy. The scientific and technical advice, training and testing by analytical and preparative (cell sorting) flow cytometry.

Empresa: INSTITUTO DE SALUD CARLOS III,Centro Nacional de Microbiología

Certificado: ER-0139/2012

Norma: UNE-EN ISO 9001:2008

Pastoreando células

En un post anterior ya hablé de los modelos animales en la investigación, un escalón por debajo de ellos está los cultivos de células; se trata de una herramienta mucho más extendida en los laboratorios y abarcan un gran número de campos de investigación.

Los cultivos celulares

Los cultivos celulares son una herramienta básica en biomedicina, tanto en el campo del diagnóstico como en la investigación. Se trata de un conjunto de técnicas encaminadas a mantener a las células favoreciendo su proliferación in vitro en un medio artificial manteniendo sus propiedades fisiológicas y genéticas. El empleo de cultivos celulares, en lugar de organismos vivos (experimentos in vivo), aporta una serie de ventajas, como son: permiten un control preciso del medio ambiente, aportan homogeneidad a la muestra, es más económico y solucionan la controversia ética de la experimentación animal. La mayor desventaja que presentan es que, al tratarse de experimentos in vitro, los resultados obtenidos pueden alejarse de lo que sucede en un organismo.

Los cultivos celulares difieren del tejido del que proceden. Se ha perdido la organización espacial tridimensional, se pierde las interacciones entre los distintos tipos celulares que forman parte de un tejido, así como entre las células y la matriz extracelular. También carecen de los componentes sistémicos que regulan la homeostasis del organismo, tales como el sistema nervioso y el sistema endocrino. Todos estos factores conllevan a que se tengan que hacer ensayos para contrastar y validar los resultados en modelos in vivo.

Algunos de los campos en los que se emplean los cultivos celulares son: en el estudio de posibles interacciones entre proteínas intracelulares, interacción entre células o patógenos, los efectos de ciertos estímulos o compuestos. Los estudios con cultivos celulares suponen una primera aproximación, previa a los estudios con organismos vivos.

Las células que se obtienen en suspensión, en ocasiones se cultivan en este estado, pero normalmente necesitan un soporte sobre el que crecer y multiplicarse, que suele ser una superficie sólida, placa o flash de plástico, sobre la que forman una monocapa.

La aparición de medios de cultivo, el uso de antibióticos y la suplementación del medio con sueros, han permitido el desarrollo y mejora de los cultivos de células animales.

La experimentación con células en cultivo requiere una serie de condiciones para su óptima realización, como son: 1.- El mantenimiento de un entorno aséptico, libre de microorganismos infecciosos, se consigue con el empleo de cabinas de flujo laminar que garantizan la esterilidad en la zona de trabajo; 2.- El control de una temperatura apropiada (37ºC) y atmósfera de CO2 (5%).

Se trata de un conjunto de técnicas encaminadas a mantener viva una población celular sobre las que luego se realizará un experimento. Son la base experimental en investigación biomédica. A estas células se las tiene que alimentar, procurarles las condiciones ambientales apropiadas (temperatura, oxígeno, pH) y mantener una gran esterilidad para que no se contaminen. El instrumento básico para observarlas es el microscopio óptico.

A: Cabina de cultivos celulares que garantizan la esterilidad; B: Estufa de cultivos; C: Microscopio confocal equipado con sistema de incubación para experimentos in vivo; D: cultivo celular fijado y teñido.

Con la colaboración de la Dra. Sonsoles Hortelado, Dr. Javier García Castro y Dra. Isabel Mirones (Instituto de Investigación en Enfermedades Raras-ISCIII).

Un pilar de la investigación

Los cultivos celulares se utilizan tanto en la investigación básica como en la aplicada. Las áreas en la investigación básica en las que los cultivos celulares son imprescindibles se centran fundamentalmente en la actividad intracelular y en la interacción con su entorno, tales como transcripción de ADN, síntesis de proteínas, metabolismo energético, señalización, apoptosis, ciclo celular, flujo intracelular de macromoléculas, transformación celular, morfogénesis, proliferación celular, adhesión, estudios de interacción huésped patógeno etc.

En la investigación aplicada, los cultivos celulares se emplean en multitud de áreas, como son: en virología para el cultivo de los propios virus y la producción de vacunas antivirales. En biotecnología para la producción industrial de fármacos en biorreactores, tales como insulina e interferón. En inmunología para la producción de anticuerpos monoclonales gracias a las técnicas de fusión celular, y en estudios de fenómenos de inflamación. En farmacología para el estudio de los efectos de fármacos, interacciones con el receptor y fenómenos de resistencia. En ingeniería de tejidos para la producción artificial de tejidos en injertos y autotransplantes. En toxicología en estudios de citotoxicidad, carcinogénesis y dosis-respuesta. En los ensayos preclínicos de nuevos fármacos.

Finde Científico, ISCIII 2014 en Alcobendas

Fluorescencia, haciendo visible lo invisible, expo Microscopía Electrónica y Confocal-ISCIII #FindeCientifico 19oct pic.twitter.com/BY3dRxpJk5

— BNCS isciii (@BNCSisciii) October 16, 2014

Este fin de semana se va a celebrar el "Finde Científico" organizado por la Fundación Española para la Ciencia y la Tecnología (FECYT).

El Finde Científico es una feria científica de carácter anual en la que participan centros educativos, museos y centros de investigación con el objetivo de fomentar la cultura científica y acercar la ciencia a la sociedad. en colaboración con el Museo Nacional de Ciencia y Tecnología.

El Instituto de Salud Carlos III participa con una serie de talleres, uno de ellos lo voy a dar yo y lleva por título "Fluorescencia, haciendo visible lo invisible". Constarará de una charla divulgativa, fundamentalmente con imágenes, haciendo un recorrido desde las células y los cultivos celulares, hasta los modelos animales en la investigación. También tendremos una exposición de fotografías y podremos observar a través de un microscopio diferentes preparaciones de células y tejidos.

Imagen: La imagen que ilustra este enlace al twitter del ISCIII corresponde a un cultivo celular de células HeLa en mitosis y ha sido cedida por el investigador Dr. Marçal Vilar (UFIEC-ISCIII), colaborador habitual con los temas relacionados con la divulgación científica que se proponen, gracias.

Espero que podáis asistir y participar del evento.

Un saludo.

La bioluminiscencia y otras luces

Luminiscencia

La luminiscencia es un proceso que tiene como resultado la emisión de luz, pero sin que sea un proceso de combustión (como el sol o el fuego), por lo que ocurre a temperatura ambiente o baja temperatura.

En la naturaleza, los seres vivos disponen de varios mecanismos para la producción de luz, el más común de ellos es gracias a la reacción química que tiene lugar entre la luciferina y la luciferasa (luminiscencia bioquímica); pero existen otros mecanismos, como la fluorescencia debida a proteínas fluorescentes, tales como la GFP (Green Fluorescent Protein).

Bioluminiscencia

Yo entiendo la bioluminiscencia como la producción de luz por organismos vivos.

Algunos autores limitan este concepto sólo a la luminiscencia producida mediante reacción química, para ellos la bioluminiscencia sería la luz producida por un ser vivo gracias a una reacción química dentro de su organismo; dejarían fuera de esta definición a la fluorescencia producida en un organismo vivo.

 Este fenómeno que se presenta en todos los niveles de la escala biológica, y ocurre con mucha más frecuencia en organismos marinos, lo presentan bacterias, algas, hongos, medusas, insectos, calamares, y peces, entre otros.

Un ejemplo típico es la luciérnaga (Lampyris noctiluca), que posee unas células especializadas en la producción de luz, estas células emiten la luminiscencia a través de la piel y se valen de cristales de urato para que actúen como reflectantes.

En muchos casos, la bioluminiscencia procede de bacterias que viven en simbiosis con otros organismos, en este caso las bacterias suele acumularse en unos órganos especiales llamados fotóforos. Estos órganos pueden tener distinto grado de complejidad, pueden llegar a estar formados por lentes, obturadores, filtros, estos fotóforos se encontrarían conectados al sistema nervioso del organismo permitiéndole controlar la emisión de luz a su propia voluntad.

La función de la bioluminiscencia es variada, a algunos animales les sirve para encontrar pareja a la hora del apareamiento (las luciérnagas), en otros casos para atraer a las presas (peces abisales), o para confundir a los depredadores (algas del placton).

El mecanismo más común para la producción de la luz es el formado por el complejo luciferina/luciferasa (figura 1), siendo la luciferina el sustrato sobre el que actúa la luciferasas, que es el compuesto que cataliza la reacción (enzima). El resultado es la conversión de energía química en energía lumínica.

Figura 1: La luciferina es el sustrato de la enzima luciferasa, que cataliza la reacción que culmina en la luminiscencia. Esta enzima necesita de la participación de la fuente de energía química (ATP), del oxígeno y del magnesio. Las luciérnagas controlan la producción de luz mediante el suministro o no de oxígeno a las células que contienen la luciferina.

El investigación, el sistema de la luciferasa es muy utilizado como herramienta de ingeniería genética para emplearlo como genes reporteros (indicadores) en los estudios de los mecanismos de expresión y regulación génica. Se venden kits comerciales que hacen que el ensayo sea rápido y sencillo, se basan en el gen luc de la luciferasa de luciérnaga.

La diferencia entre luminiscencia bioquímica y fluorescencia es que en la primera, la energía necesaria para que se produzca la emisión de luz procede de una reacción química, mientras que en la fluorescencia, la energía necesaria procede de la absorción de un fotón seguida de la emisión de otro fotón.

Fluorescencia

La fluorescencia es un fenómeno que está ampliamente extendido en la naturaleza, existen muchos compuesto capaces de emitir fluorescencia (podéis leer la entrada “La fluorescencia, haciendo visible lo invisible”), pero también se presenta como un fenómeno bioluminiscente. La luz verde que emiten ciertas medusas (como ejemplo Aequorea victoria) es debida a fenómenos de fluorescencia gracias a la proteína verde fluorescente (GFP). Se siguen buscando otras proteínas fluorescentes en animales marinos, en la actualidad disponemos de la proteína DsRed obtenida a partir del cnidario Discosoma sp., en este caso la emisión de luz es en rojo.

El descubrimiento y posterior desarrollo de la proteína GFP, supuso el Premio Nobel de Química en el 2008 a sus autores. Gracias a estas propiedades fluorescentes y a la capacidad que tenemos actualmente para manejar el gen que codifica la proteína, se ha convertido en una herramienta clave para la observación de la expresión génica, muy utilizada en ensayos in vivo para estudiar la migración celular, expresión de proteínas y un larguísimo etcétera. Se han mejorado sus propiedades y se han obtenido algunas variantes que son capaces de emitir fluorescencia en otras longitudes de onda.

Figura 2: Expansión a lo largo del tiempo de células tumorales marcadas con la proteína verde fluorescente (GFP).

Fosforescencia

En la fosforescencia, al igual que en la fluorescencia, la energía necesaria para que se produzca la emisión de luz procede de otra luz (un fotón). Por lo que hablados en los dos casos de luz de excitación y luz de emisión. La diferencia entre fluorescencia y fosforescencia es que en el primer caso, cuando dejamos de iluminar con la luz de excitación, se deja de emitir luz, mientras que en la fosforescencia, la luz de emisión puede durar durante un tiempo, incluso una vez que se ha dejado de excitar. El caso típico para ilustrar la fosforescencia son las típicas pegatinas que se exponen a la luz y una vez que en la oscuridad, las pegatinas continúan emitiendo luz (fosforescencia).

Figura 3: Un fluoróforo es una molécula capaz de absorber un fotón, cuando esto sucede pasa de un estado relajado a un estado excitado debido al exceso de energía que posee. La tendencia de esta molécula es volver a su estado relajado y “liberarse” de ese exceso de energía. Los fluoróforos lo hacen emitiendo un fotón. Tanto en los procesos de fluorescencia como de fosforescencia, se produce la absorción de un fotón y la emisión de otro fotón. La diferencia radica en que en la fosforescencia las moléculas pueden seguir emitiendo fotos incluso una vez que ha cesado la excitación.

Un enlace de interés:

http://jralonso.es/2010/08/03/bioluminiscencia/

Los modelos animales en la investigación biomédica

Los modelos animales en la investigación biomédica

Los modelos animales se han utilizado en investigación desde hace muchísimos años y constituyen un paso fundamental en el estudio de enfermedades humanas. Su uso se ha ido acotando poco a poco, pero sigue siendo un pilar insustituible en multitud de estudios.

Se emplean fundamentalmente en la investigación y la industria y hasta hace unos años, también en docencia.

En las universidades se utilizaban en prácticas para aprender y observar procesos fisiológicos, características anatómicas, y adquirir las destrezas necesarias en cirugía. Es en este campo se está reduciendo mucho el empleo de animales siendo reemplazado por alternativas como simulaciones por ordenador.

Dentro de la industria, donde más se empelan animales de laboratorio son, en la prueba y producción de nuevas moléculas de interés, como pueden ser los fármacos;  y en las pruebas de seguridad y toxicidad de productos de consumo. En este campo también se está intentando reducir el número de animales que se emplean con estos fines, para ello se están introduciendo modelos matemáticos y la simulación por ordenador de las interacciones fármaco-proteína (modelo in silico).

En investigación se emplean  para progresar en el conocimiento científico, como modelos en el estudio de enfermedades y para probar y desarrollar nuevas terapias.

Los animales se emplean para garantizar la seguridad de los nuevos fármacos antes de ser administrados a las personas durante los ensayos clínicos, esta etapa previa se conoce como ensayos preclínicos y están encaminados a evaluar su toxicidad, la eficacia, vía de administración, efectos secundarios y validar su potencial terapéutico. Estos ensayos preclínicos primero se realizan sobre cultivos celulares, y en una etapa posterior, sobre animales de laboratorio.

Además de emplearse en los campos ya citados, los animales también son necesarios para la obtención de sueros y proteínas sanguíneas, producción de vacunas, producción de anticuerpos que serán empleados en multitud de técnicas de laboratorio (inmunoensayos), producción de anticuerpos con fines terapéuticos, obtención de células y órganos.

La comunidad científica no es insensible a los prejuicios éticos y morales que supone el trabajar y sacrificar animales. En una sociedad del bienestar y el conocimiento no queda justificado ejercer crueldad sobre los animales y es responsabilidad de la comunidad científica no ocasionar daños innecesarios. Por ello, se ha convertido en una prioridad buscar formas de reemplazar y reducir el número de animales en la experimentación.

Para garantizar el bienestar de los animales, su cuidado, evitar el dolor y el estrés, se ha desarrollado una legislación muy estricta y se han establecido comités de bioética que velan por el cumplimiento de estos objetivos.

Los fundamentos para un uso racional de los animales se basan en el principio de las tres R’s: Reducir, reemplazar y refinar. Reducir implica utilizar el menor número posible de animales que permitan obtener resultados científicamente válidos. Reemplazar es sustituir el empleo de animales por métodos alternativos como son los modelos matemáticos, cultivos celulares, simulación por computación (modelos in silico), siempre que sea posible. Refinamiento supone utilizar estándares internacionales de procedimientos encaminados a minimizar el dolor y asegurar el bienestar de los animales. Asegurar el bienestar de los animales implica obtener resultados más fiables y supone, en la práctica, la reducción en el número de experimentos necesarios a realizar.

Los métodos alternativos al empleo de animales nos son muy útiles para disminuir el número de animales necesarios en la experimentación, pero no pueden predecir con fiabilidad los efectos que tendrían en un organismo debido a la gran complejidad de un ser vivo completo. En la actualidad, lo más razonable parece ser considerar el empleo de animales como modelos como una herramienta imprescindible para la investigación, prevención y cura de enfermedades humanas, empleando en la medida de lo posible alternativas válidas, reducir el número de animales a emplear y disminuir el sufrimiento de los animales.

Microscopía de fluorescencia confocal de un corte de cerebro de ratón.
A: hemisferio izquierdo; B: hemisferio derecho; C: corteza cerebral; D: Cuerpo calloso; E: ventrículo lateral; F: tercer ventrículo; G: región CA del hipocampo; H: giro dentado del hipocampo

Imagen obtenida en la colaboración de las Dras Pilar Sánchez y Cristina Zahonero (UFIEC-ISCIII)

El ratón como modelo animal

Se emplean muchos animales como modelos en la investigación, pero es, sin duda, el ratón el más utilizado en la mayoría de los experimentos en los campos de la medicina y la biología.

Los ratones muestran una serie de ventajas con respecto a otros animales de experimentación; son animales complejos capaces de reproducir enfermedades humanas, son pequeños y manejables, su mantenimiento es fácil y no muy costoso, con un corto periodo reproductivo con camadas grandes. Otra serie de ventajas son las metodológicas, se puede manipular su carga genética con relativa facilidad, se poseen herramientas moleculares como son sondas de cDNA y abundantes anticuerpos específicos, existen más de 450 cepas consanguíneas diferentes y existe un bagaje histórico en los laboratorios muy importante.

Es el modelo experimental elegido especialmente en los campos de los trastornos inmunológicos, como pueden ser las enfermedades autoinmunes y la hipersensibilidad tardía o alergia, en oncología, o en infecciones experimentales por diferentes organismos, también se emplea en embriología, aunque en este campo está ganando terreno un animal de experimentación emergente como es el pez cebra, que ofrece otra serie de ventajas en este tipo de estudios.

La gran importancia de este animal al avance en el conocimiento de las enfermedades humanas radica en la disponibilidad que se tiene de manejar animales transgénicos, knock-out y cepas consanguíneas permitiendo el estudio in vivo de la función de determinados genes y su influencia en el desarrollo de las enfermedades de origen genético.

Embrión de pez cebra

Con la colaboración de la Dra Aránzazu Sanchis Otero y el Dr. Jesús Pablo García Cambero,  CNSA-ISCIII

Para saber más:

El modelo animal en la investigación biomédica. Silvia Hernández. Biomedica, 2 (3), 252-256. (2006)

Ética de la investigación en modelos animales de enfermedades humanas. Eduardo Rodríguez Yunta. Acta Bioethica, 13 (1), 25-40 (2007)

La fluorescencia, haciendo visible lo invisible

Voy a comenzar con algunos extractos del libro que estoy escribiendo "La microscopia confocal en el Instituto de Salud Carlos III", espero que os resulte interesante.

Capítulo 1. La fluorescencia, haciendo visible lo invisible

La luz visible por el ojo humano (luz blanca) es una pequeña banda del espectro electromagnético que incluye diferentes tipos de radiaciones (rayos gamma, rayos X, ultravioleta, visible, infrarrojo, microondas, ondas de radio). El rango espectral de la luz blanca comprende de los 400 a los 700nm, aunque algunas personas pueden percibir entre los 380 y 780nm. A su vez, la luz blanca engloba a radiaciones con diferentes longitudes de onda que corresponde a colores concretos.

Aunque convencionalmente se nombran y se separan los colores que aparecen al hacer pasar la luz blanca por un prisma que dispersa la luz en sus componentes, la realidad es que la variación del color a lo largo del espectro es continuo y no existen saltos entre los diferentes colores (figura 1). Por otro lado, una radiación electromagnética monocromática sólo contiene un componente de una determinada longitud de onda, como es el caso de la luz láser.

Figura 1: Algunas formas de radiación electromagnética, que incluye los rayos gamma, rayos X (RX), radiación ultravioleta (UV), visible, radiación infrarroja (IR) y microondas. Se muestra la banda del espectro electromagnético correspondiente a la luz visible y las longitudes de onda que corresponden a diferentes colores. Cuanto menor es la longitud de onda, mayor es la frecuencia y mayor es la energía asociada.

La microscopia de fluorescencia se basa en la capacidad que tienen ciertas moléculas para absorber energía procedente de una estrecha banda del espectro de la luz, habitualmente expresado con el valor de la longitud de onda donde tiene su máxima absorción seguido de la emisión de luz en un rango de longitud de onda mayor (figura 2).

Figura 2: Hipotético fluorocromo capaz de abosrber radiación entre los 350 nm y los 460nm, teniendo un pico máximo de absorción a los 420nm, estas longitudes de onda corresponden a la franja de luz azul dentro del espectro visible. A su vez, este fluorocromo es capaz de emitir luz verde en la franja comprendida entre los 440 nm y los 600, teniendo su máximo a los 480nm.

Gracias a esta propiedad de absorber y emitir luz en determinadas franjas del espectro de luz y a la existencia de tinciones, anticuerpos y sondas específicas, se pueden combinar obteniendo resultados espectaculares. Estos resultados se pueden enmarcan en su contexto celular, de órgano o de organismo (figura 3).

Figura 3: Imagen de microscopía de fluorescencia confocal. Cultivo de células pulmonares, en azul está teñido el núcleo, en verde el citoesqueleto de actina y en rojo las mitocondrias.

Junto a este hecho transcendental ocurrieron otros dos que supusieron colocar a la microscopía óptica en la punta de lanza de la investigación biológica. Por un lado se desarrolló el sistema confocal que permitía obtener imágenes de alta calidad y resolución eliminando la luz fuera de foco y por otro, la accesibilidad a equipos informáticos potentes, capaces de almacenar gran cantidad de información a una velocidad aceptable y a unos costes razonables.

Los microscopios de epifluorescencia comenzaron a utilizarse de manera habitual en los laboratorios a principios de la década de los 70 del siglo pasado. Las primeras aplicaciones en las que se empleó se basaron en la observación de la fluorescencia primaria, o autofluorescencia que poseen determinadas sustancias. Pero el boom no llegaría hasta los años 90, cuando se comenzó a manipular el gen que codifica la proteína verde fluorescente (GFP), aislada de la medusa Aequorea victoria, mejorando sus propiedades y obteniendo una serie de proteínas derivadas capaces de ser excitadas y emitir fluorescencia en otras longitudes de onda diferentes al verde.